反相HPLC色谱柱的清洁和再生

时间:2019-03-04 08:17:05 来源: 2019时时彩十大平台最新排行榜 作者:匿名


反相色谱是迄今为止在高效液相色谱中使用最广泛的技术,主要是因为它适用于分析大多数非极性物质和许多可电离和离子化合物。反相色谱中使用的大多数固定相是天然疏水材料,因此分析物通过它们与固定相的疏水相互作用而分离,疏水机制也可以以相同的方式分离。

固定相上还有一些物质,例如混合相(例如苯基 - 己基),末端封端和非末端封闭的物质和极性嵌入相 - 也存在于这些键合的硅胶上。还有许多用于反相色谱的填料,包括涂有硅胶和氧化铝的聚合物,无机 - 有机混合物,涂覆的氧化锆和石墨化碳。不同类型的固定相具有各自的优点和缺点。

反相色谱柱可用于各种流动相和添加剂的各种应用。一些技术利用添加剂来改性或改性填料的表面。有时这些添加剂可能污染键合相的表面。

由于其疏水键合相,硅胶表面具有一些其他化学性质。残留的硅烷醇存在于所有二氧化硅粘合的填料中。这些硅烷醇具有弱酸性,因此能够将基质组分,特别是碱性组分与某些分析物结合。由于硅烷醇的pKa值约为4.5,因此在中性pH条件下可发生电离,因此可发生与阳离子的静电相互作用。较旧的A型硅胶可以容纳高浓度的金属离子(有时为100 ppm或更高),这可以使硅胶表面更酸,甚至金属螯合或清除某些化合物。残留的硅烷醇在非末端封闭的硅胶短链键合相如C2或C4上更令人讨厌。

用户必须了解他们正在使用的固定相表面的特定性质以及分析物 - 静止表面的可能相互作用,以便他们在使用反相方法时可以考虑可能的基质相互作用。例如,非常疏水的样品基质如玉米油,高香气和蜡可以粘附到固定相负载表面并改变它们的性质。含有蛋白质材料的生物流体也可以吸附在装载表面上。尽管分析人员希望尽最大努力保护HPLC色谱柱,但某些分析物 - 基质污染会对固定相产生不利影响。当色谱柱被污染时,其色谱行为将与未受污染的色谱柱略有不同。受污染的色谱柱会产生背压问题。必须清洁和再生受污染的反相色谱柱,以恢复原始操作条件。 “Pillar Observations”的这一部分将讨论将色谱柱恢复到原始状态或几乎原始状态的可能方法。由于键合硅胶柱是最受欢迎的,我专注于这种类型的色谱柱。最后,我将讨论其他反相色谱柱的清洗步骤。

什么原因导致反柱污染发生?通常,样本包含分析师不感兴趣的内容。盐,脂质,含脂质物质,腐殖酸,疏水性蛋白质和其他生物物质是在使用过程中可能与HPLC柱相互作用的物质。这些物质的保留率低于或高于分析师的目标。具有较低保留值的物质(例如盐)通常以空体积从柱中冲出。来自这些非目标产物的干扰可以被检测器检测到并且可以形成峰,气泡,基线偏移或负峰。如果样品组分牢固地保留在色谱柱中并且流动相溶液组分不足以洗脱这些物质,则吸附在色谱柱表面上的物质通常会在多次加载后积聚在色谱柱头中。这些行为通常只能通过平行实验发现。具有中等保留值的样品可以缓慢洗出并显示为宽峰,基线干扰或基线漂移。

有时这些吸附的样品组分在一定程度上累积,它们开始形成新的固定相。分析物可以与这些杂质相互作用以形成某种分离机制。保留时间会波动,尾部会出现。如果发生足够的污染,色谱柱的背压可能超过泵可承受的最大压力,使色谱柱无法操作并在堵塞时产生空隙。

清洁硅胶粘合柱

再生受污染的HPLC色谱柱的关键是了解污染物的性质并找到合适的溶剂去除。如果在重复进样过程中污染是由强烈保留的材料积聚造成的,那么去除这些污染物的简单步骤通常可以恢复其色谱行为。偶尔,在几次操作之后,用90至100%溶剂B(双溶剂反相系统中的较强溶剂)冲洗柱以除去污染物。 (表2列出了不同规格的HPLC色谱柱的空体积,因此读者可以轻松确定相应色谱柱冲洗液的体积。)例如,色谱柱中的残留脂质可以用非水溶剂如甲醇处理,乙腈或四氢呋喃。如果使用缓冲系统,请勿直接切换到强溶剂。突然切换到高浓度的有机溶剂可能会使HPLC流动系统中的缓冲液沉淀,这会导致更大的问题,例如色谱柱堵塞,管道堵塞,泵泄漏,活塞损坏或喷射阀轴故障。应首先使用无缓冲流动相(即缓冲液应更换为水)。冲洗5至10倍后,更换强溶剂。有时,强溶剂不能洗去留在柱上的污染物。清洁色谱柱需要更强的溶剂或一系列溶剂。如果污染物是非生物物质,则使用者可以跳过一种或多种另外的有机溶剂以除去污染物。溶剂和溶剂之间有许多组合。推荐的溶剂系统可在色谱柱制造商的网页上找到。

通常,所有清洁方法都具有类似的形式。所用溶剂均随溶剂强度增加,通常最后一种溶剂非常疏水(如乙酸乙酯或甚至碳氢化合物),可用于溶解非极性物质,如脂类和油类。我们必须确保一系列溶剂中的每种溶剂与下一种溶剂混合。在清洁过程结束时,必须通过中等强度的混合溶剂将其返回到原始溶剂系统。例如,异丙醇作为中间步骤是非常好的溶剂,因为它可与正己烷或二氯甲烷混溶并且可与水相溶剂混溶。但是,异丙醇非常粘稠,必须保持低流速以避免过度泵送。当然,如果您使用紫外检测器,请避免在紫外线区域吸收溶剂,或使用大量溶剂冲洗来稳定基线。

对于典型的硅胶柱,如果没有缓冲溶液,建议使用以下溶剂系列:

100%甲醇

100%乙酰基

75%乙酸乙酯-25%异丙醇

100%异丙醇

100%二氯甲烷

100%正己烷

使用二氯甲烷或正己烷后,可以使用原始水相溶剂,因为溶剂相容柱必须用异丙醇冲洗。每种溶剂至少洗涤10个柱体积。例如,一个250mm×4.6mm的HPLC分析柱,分析人员可以用1~2ml/min的流速冲洗,恢复原有的溶剂体系,不需要每步冲洗,也可以跳过中间步骤。中间步骤建议使用异丙醇,然后使用无缓冲的流动相,最后使用初始流动相配置。四氢呋喃是另一种用于去污的流行溶剂。如果使用者怀疑该柱受到严重污染,可以将其与二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺和水以50:50的比例混合,以小于0.5ml/min的流速流过该柱。反相柱的成功再生是非常耗时的过程,并且可以使用梯度系统在一夜之间进行溶剂冲洗。摘自:中国分析测量网络

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